Главное меню

Принцип MLPA технологии

(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

Пример заключения
«MLPA-эпилепсия»

Как указано на рисунке 1 принцип основан на амплификации до 60 зондов различной длины (за счет использования одной и той же пары ПЦР праймеров, т.е. одна пара праймеров садится на константные участки всех разновидностей гибридизационных зондов). Один и тот же прямой и обратный праймеры отжигаются на концевых константных ПЦР-последовательностях (~ 60 п.н.) каждого гибридизационного зонда. Данная ПЦР характеризуется высокой воспроизводимостью, поскольку в реакции принимает участие только одна пара праймеров для амплификации всех зондов разной длины.

Рис. 1. MLPA-реакция
Рис. 2. Этапы MLPA-реакции

После денатурации образца ДНК, к нему добавляют смесь гибридизационных MLPA-зондов. Каждый MLPA-зонд состоит из двух олигонуклеотидов. Если в образце (мишень) присутствует последовательность комплементарная зонду, то оба олигонуклеотида гибридизуются друг за другом, так чтобы быть сшитыми лигазой в единый зонд. Лигированные олигонуклеотидные зонды разной длины затем одновременно амплифицируются в ходе ПЦР с использованием одних и тех же праймеров. Происходит амплификация не ДНК образца (мишени), а мультиплексной смеси лигированных зондов разной длины.

Рис. 3. Этапы MLPA-реакции

Каждый зонд в MLPA-миксе имеет уникальный длину в интервале от 130 до 500 п.о. В ходе ПЦР смесь легированных зондов разной длины амплифицируется одновременно с использованием одной и той же пары праймеров. Один из ПЦР праймеров несет флуоресцентную метку, что позволяет визуализировать продукты амплификации в процессе разделения фрагментов в ходе капиллярного электрофореза (рис. 4, слева).

Рис. 4. А) Электрофореграмма тестируемого образца (внизу) в сравнении с референсным образцом (вверху) показывает относительное снижение высоты пиков трех зондов (показаны стрелками). В) Отношение высот пиков одноразмерных зондов в тестовом и референсном образцах. Размещение зондов в соответствии с их локализацией на хромосоме показывает уменьшение числа копий трех смежных зондов в тестовом образце

Сравнение высоты пиков зондов тестового образца с высотой пиков зондов референсного образца отражает относильное число копий соответствующих целевых последовательностей в тестовом образце. Удаление одной или нескольких целевых последовательностей со всей очевидностью приводит к относительному уменьшению высоты пика (рис. 4, справа), в то время как увеличение относительной высоты пика свидетельствует об амплификации числа целевых последовательностей.

Рис. 5. MLPA-реакция (принцип лигирования)
MLPA – Специальная форма мультиплексной ПЦР
► Апмплифицируется MLPA-зонд, а не образец ДНК-мишени.
► Генерируются паттерны пиков от образца ДНК пациента и контрольной ДНК. Сравнивается относительная высота пиков.
► Различие отражает изменения числа копий последовательностей к которым специфичны зонды.
► Более 50 гибридизационных зондов присутствует в одной реакции MLPA.
► Выявляет аномальное число копий более 40 ДНК последовательностей в ходе одной ПЦР реакции
► Используется:
- для детекции изменения числа копий
- определения статуса метилирования импринтинговых и промоторных регионов
- определения относительного количества мРНК
- определения известных точечных мутаций (SNP)
► Требуется минимум ДНК – 20 нг (3000 клеток)
► Дискриминирует последовательности различающиеся в 1 нуклеотид
► Работает с деградированной ДНК (парафиновые срезы, фиксированные ткани)
► MLPA определяет относительное количество целевых последовательностей
► Женские диплоидные и триплоидные клетки не могут быть различимы

Рис. 6. Определение числа Х-хромосом: 1, 2 и 3 копии на клетку
Рис. 7.ДНК референсного образца (вверху) и ДНК пациента с делецией гена BRCA1 в 13 экзоне (внизу). Анализ выполнен с использованием SALSA® MLPA® probemix P002 BRCA1. Обозначения: с – референсные зонды (зеленые); 1А–24 обозначение зондов для определения соответствующих экзонов гена BRCA1. При сравнении паттерна пиков в образце пациента отчетливо видно снижение высоты пика от зонда соответствующего 13 экзону относительно референсного образца.

Место MLPA среди других методов генетической диагностики

Технология MLPA позволяет выявлять широкий диапазон генетических нарушений – от точечных мутаций единичных нуклеотидов до делеций/дубликаций обширных хромосомных регионов.

Возможные варианты для заказа