Главное меню

Цифровая ПЦР

Использование метода ddPCR для скрининга соматических мутаций в онкологии

Использование методов таргетной терапии опухолей (моноклональные антитела к рецепторам EGFR, ERBB2, ERBB3 и ингибиторы тирозинкиназ) при лечении пациентов с различными онкологическими заболеваниями обладает высокой эффективностью только в тех случаях, если персонализировать исходный статус чувствительности/устойчивости и/или мониторировать во времени изменяющийся статус опухолевых клеток по отношению к используемым терапевтическим подходам.

Использование более чувствительного и прямого количественного метода детекции в виде digital droplet PCR (ddPCR) позволяет решить сразу несколько важных задач: повысить надежность детекции событий (помехоустойчивость), значительно увеличить чувствительность детекции соматических мутаций и осуществить мониторинг изменяющегося мутационного статуса опухолевых клеток. Активирующие мутации в генах сигнального пути KRAS сообщают опухолевым клеткам устойчивость к таргетным препаратам, направленным на рецептор EGFR, в целом повышая их пролиферативный потенциал и выживаемость. Поэтому целью подобного рода исследований служит скрининг соматических активирующих мутаций в генах сигнального пути EGFR в процессе лечения пациентов противоопухолевыми препаратами.

Технология цифровой капельной полимеразной цепной реакции (Digital Droplet PCR) была разработана для обеспечения высокочувствительного, высокоточного, абсолютного количественного анализа целевых последовательностей нуклеиновых кислот с широким применением как для исследовательских целей, так и для клинической диагностики. Droplet Digital PCR определяет абсолютные величины ДНК-мишеней путем подсчета молекул нуклеиновых кислот, инкапсулированных в масляно-водной эмульсии.

Высокая чувствительность данного метода позволяет проводить высокочувствительный скрининг соматических мутаций как из гистологических срезов опухолевой ткани, так и из свободно-циркулирующей в крови опухолевой внеклеточной ДНК (cell free DNA). В связи с тем, что количество внеклеточной ДНК очень мало, использование обычных методов ПЦР может быть не эффективным. Для преодоления этих трудностей оптимальным является метод цифровой капельной ПЦР (Droplet Digital PCR). Это усовершенствованная технология, при которой реакционная смесь распыляется на множество мельчайших капель (более 20 тысяч), в каждой из которых протекает индивидуальная ПЦР практически с единичных молекул ДНК-матрицы. Метод характеризуется высочайшей чувствительностью и возможностью количественного определения чрезвычайно редко встречающихся ДНК-мишеней.

Метод Чувствительность (%) детекции ДНК
RT-PCR 0.5-5
High Resolution Melting (HRM) 5-7
Секвенирование по Сэнгеру 15-25
ddPCR 0,05-0,1
ПРИМЕРЫ ЗАКЛЮЧЕНИЙ
ПУБЛИКАЦИИ

1. Кит О. И., Водолажский Д. И., Енин Я. С., Геворкян Ю. А., Владимирова Л. Ю.Выявление single nucleotide polymorphism - мутаций в гене BRAF методом digital droplet PCR при меланоме кожи. В материалах III Петербургского онкологического форума "Белые ночи - 2017", 2017 года.

2. Кит О.И., Водолажский Д.И., Енин Я.С., Туркин И.Н., Лазутин Ю.Н., Владимирова Л.Ю. Скрининг SNP-мутаций в гене KRAS методом Digital Droplet PCR при аденокарциноме легкого. В материалах III Петербургского онкологического форума "Белые ночи - 2017", 2017 года.

3. Кит О.И., Водолажский Д.И., Енин Я.С., Геворкян Ю.А., Владимирова Л.Ю. Выявление SNP-мутаций в гене KRAS методом Digital Droplet PCR при аденокарциноме толстой кишки. В материалах III Петербургского онкологического форума "Белые ночи - 2017", 2017 года.

4. Водолажский Д.И. Диагностика KRAS-мутаций методом Digital Droplet PCR при злокачественных новообразованиях различной локализации. В материалах X съезда онкологов и радиологов стран СНГ и Евразии. 23-25 апреля 2018 г., г. Сочи.

5. Водолажский Д.И., Гудков Г.В., Филиппов Е.Ф., Мурашко Р.А., Крутенко Д.В. ddPCR-скрининг мутационного статуса генов BRAF и KRAS у пациентов юга россии // Современные проблемы науки и образования.2019. – № 1.; URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=28576

6. Водолажский Д.И., Гудков Г.В., Филиппов Е.Ф., Мурашко Р.А., Тен Ф.П. Повышение чувствительности выявления активирующих соматических мутаций в опухолях толстой кишки при помощи метода ddPCR // Современные проблемы науки и образования. – 2019. – № 4; URL: http://www.science-education.ru/article/view?id=29044