Главное меню

Диагностика генетических полиморфизмов

Генетический паспорт – это индивидуальная генетическая карта, которая позволяет с высокой долей вероятности оценить риск проявления заболеваний, а также смягчить или исключить их развитие при своевременном принятии профилактических мер. Важно понимать, что наличие SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) полиморфизмов не означает, что заболевание обязательно будет развиваться. Они могут обусловить больший или меньший риск развития болезни под действием тех или иных факторов.

Анализ SNP в геноме человека c масс-спектрометрической схемой детекции результата (в отличие от обычной ПЦР), является одним из наиболее точных и высокопроизводительных методов.

ПРИНЦИП МЕТОДА
    Процесс идентификации SNP состоит из следующих этапов:
  1. Выделение ДНК из образца биоматериала;
  2. Проведение ПЦР для увеличения числа копий участка ДНК, последовательность которого включает исследуемый полиморфизм;
  3. Очистка ПЦР-продуктов щелочной фосфотазой (SAP) – инактивация нуклеотидов (dNTP), оставшихся в ПЦР-смеси;
  4. Проведение минисеквенирования (линейная амплификация), где в качестве матрицы используют ПЦР-продукт;
  5. Суть реакции заключается в проведении реакции амплификации с использованием олигонуклеотидного зонда, 3’-конец которого отжигается непосредственно перед нуклеотидом в котором происходит замена (полиморфизм).

    Принципиальная схема минисеквенирования и масс-спектрометрического анализа продуктов реакции представлена на рисунке ниже.

  6. Очистка продуктов минисеквенирования от положительно заряженных ионов с помощью катион-обменной смолы;
  7. Нанесение матрицы и образцов на ancor-chip (MALDI-мишень); Для образования ионов, исследуемых олигонуклеотидов в MALDI анализе, используется вспомогательное вещество – 3-гидроксипиколиновая кислота (3-HPA), или МАТРИЦА.
  8. МАТРИЦА
    3-гидроксипиколиновая кислота

    Матрица поглощает излучение лазера и вторично ионизирует исследуемые олигонуклеотиды.


    Для нанесения образцов используется аналитическая мишень AnchorChip 400TF-384 (Bruker Daltonics) – стальной тефлонизированный планшет на 384 образца.
  9. Регистрация MS-спектров на масс-спектрометре и интерпретация результатов;

Регистрация спектров продуктов реакции минисеквенирования проводится на MALDI масс-спектрометре Bruker серии Flex с помощью программы FlexControl как в ручном, так и в автоматическом режимах.

Исследуя спектр масс образца после реакции минисеквенирования, можно определить генотип SNP для любого образца ДНК.

При наличии выделенной ДНК протокол осуществляется за 6-8 часов.

Пример заключения
«Определение полиморфизмов (SNP)»
ПУБЛИКАЦИИ

Гудков Г.В., Филиппов Е.Ф., Тен Ф.П., Крутенко Д.В., Тарасов Я.В., Курелинок С.А., Пивень А.В., Демченко Л.С. Возможность определения однонуклеотидных полиморфизмов и HLA-генотипирования эмбрионов на основании генетического материала бластомеров в программах преимплантационного скрининга // Научный журнал КубГАУ [Электронный ресурс]. – Краснодар: КубГАУ, 2017 . – №10(134). – Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2017/10/pdf/08.pdf , 1,000 у.п.л. – IDA [article ID]: 1341710008. http://dx.doi.org/10.21515/1990-4665-134-008