Главное меню

Секвенирование

Секвенирование ДНК – это процесс определения порядка следования нуклеотидов в ДНК. Он включает в себя любой метод или технологию, которые используются для определения порядка следования четырех оснований: аденин, гуанин, цитозин и тимин. Появление быстрых методов секвенирования ДНК значительно ускорило биологические и медицинские исследования и открытия.

Знание порядка расположения нуклеотидов в ДНК необходимо для фундаментальных биологических исследований и во многих прикладных областях, таких как медицинская диагностика, биотехнология, криминалистическая биология, вирусология и биологическая систематика. Быстрая скорость секвенирования, достигнутая с помощью современной технологии секвенирования ДНК, способствовала секвенированию полных последовательностей ДНК или геномов различных типов и видов жизни, включая геном человека и другие полные последовательности ДНК многих животных, растений и микробов. виды. Пример результатов автоматического секвенирования ДНК с терминацией цепи.

HLA-генотипирование методом секвенирования

Полиморфизм генов HLA-комплекса обусловлен существованием в человеческой популяции огромного разнообразия аллельных вариантов этих генов. Различные аллели отличается друг от друга определенным количеством нуклеотидных замен в гене того или иного локуса HLA. Во всех прочих генетических методах HLA-типирования для определения различных аллельных вариантов генов комплекса гистосовместимости используют либо уникальные праймеры в реакции ПЦР, либо олигонуклеотидные зонды в реакции гибридизации. Метод секвенирования ДНК позволяет напрямую определить первичную последовательность типируемого гена того или иного локуса HLA.

Секвенирование генов HLA, в отличие от других методов HLA генотипирования, позволяет проводить определение аллельных вариантов путем прямого сравнения первичных последовательностей нуклеотидов в цепочке ДНК анализируемого образца с консенсусной последовательностью нуклеотидов в соответствующем гене HLA в базе данных.

HLA-типирование методом секвенирования ДНК дает возможность проводить анализ на среднем и высоком разрешении с использованием минимальных количеств ДНК (всего 2-5 мкл ДНК с концентрацией 15-30 нг/мкл для типирования по одному локусу).

    Области применения:
  • трансплантология
  • онкогематология
  • создание регистров доноров костного мозга
  • популяционные научные исследования
ПРИМЕР ЗАКЛЮЧЕНИЯ
«Исследование мутационного статуса 15 экзона гена BRAF
методом прямого секвенирования по Сэнгеру»
Государственное бюджетное учреждение здравоохранения
Детская городская клиническая больница города Краснодара
министерства здравоохранения Краснодарского края
(ГБУЗ «ДГКБ г. Краснодара» МЗ КК)
Центр репродуктивной клеточной медицины
350012, г. Краснодар, ул. им. Ак. Лукьяненко П.П., д.97, тел. 8(861)222-46-02
ФИО:
Пол: xxxxxxx Полис: СНИЛС:
Адрес: xxxxxxx моб. тел.: Дата рождения: xxxx
email:
Направившее учреждение МБУЗ Детская городская клиническая больница №1 г. Краснодара
Диагноз заболевания злокачественная меланома кожи Код заболевания:
по МКБ 10
C43
Дата поступления образца: xxxxxxxxx

Цель исследования – определение мутационного статуса 15 экзона гена BRAF методом прямого секвенирования по Сэнгеру.

Преимуществом данного метода является возможность проводить множественный скрининг активирующих мутаций, охватывающих однонуклеотидные полиморфизмы, инсерции и делеции в 15 экзоне гена BRAF, в отличие от точечного анализа мутаций методом RT-PCR. Мутационный статус 15 экзона гена BRAF является важным диагностическим предиктором эффективности применения таргетных препаратов при лечении онкологических заболеваний. Подавляющее количество активирующих мутаций в этом гене по данным международной базы данных COSMIC встречается именно в 15 экзоне.

Биоматериал – биоптат злокачественной меланомы кожи у пациента ХХХХХХ с морфологически подтвержденным диагнозом злокачественная меланома кожи. Для молекулярно-генетического исследования использовали 3 мкм срезы парафиновых блоков (FFPE) биоптатов новообразований.

Экстракция ДНК включала стандартную процедуру депарафинирования в орто-ксилоле, лизис в 2% SDS - буфере в присутствии протеиназы K и дополнительную очистку от ингибиторов на колонках QIAamp® DNA FFPE TissueKit (QIAGENE, Germany). Для проведения ПЦР концентрацию ДНК нормализовывали до величины 4 нг/мкл.

Полимеразную цепную реакцию для 15 экзона гена BRAF проводили с использованием пары праймеров 5’-TGCTTGCTCTGATAGGAAAATGAGA-3’ (Forward) и 5’-AACTCAGCAGCATCTCAGGG-3’ (Reverse). Режим термоциклирования на амплификаторе Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, USA) проходил по программе: первичная денатурация при 95оС (3 минуты) и последующие 39 циклов в режиме: денатурация - 95оС – 15 сек., отжиг – 63оС -15 сек., элонгация при 72оС - 20 сек. и заключительная элонгация 72оС – 25 мин.

Секвенирующая ПЦР включала стандартный протокол для набора ABI Prism BigDyeTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits с использованием амплификатора Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, USA) и режима термоциклирования: первичная денатурация при 96оС (1 минута) и 28 циклов в режиме: денатурация - 96оС – 10 сек., отжиг - 50оС - 5 сек., синтез при 72оС-4 мин.

Секвенирование по Сенгеру выполняли на генетическом анализаторе ABIPrism 3500 XL (Life Technologies, USA).

Результаты по пациенту ХХХХХХ

На проанализированном участке 15-го экзона гена BRAF с наибольшей вероятностью активирующих мутаций отличий от референсной последовательности не обнаружено.

Данные полностью подтверждены на реверс-последовательности и поэтому являются надёжными. Ожидаемая точка мутации V600E выделена цветом.

Заключение. Возможные активирующие мутации в 15 кодоне гена BRAF c.1789_1790CT>TC (p.L597S), c.1789C>G (p.L597V), c.1790T>A (p.L597Q), c.1798_1799GT>AA (p.V600K), c.1790T>G (p.L597R), c.1798G>A (p.V600M), c.1798_1799GT>AG (p.V600R), c.1799T>A (p.V600E), c.1799T>C (p.V600A), c.1799T>G (p.V600G) и c.1801A>G (p.K601E) в образце пациента ХХХХХХ отсутствуют (V600E выделено цветом).

Рекомендация. Применение таргетных препаратов для лечения меланомы кожи у данного пациента не целесообразно.