Горячая линия:

8 (861) 222-75-82

Справочная:

222-42-77

г. Краснодар ул. Академика Лукьяненко П.П., дом 97

mlpa23

Как указано на рисунке 1 принцип основан на амплификации до 60 зондов различной длины (за счет использования одной и той же пары ПЦР праймеров, т.е. одна пара праймеров садится на константные участки всех разновидностей гибридизационных зондов). Один и тот же прямой и обратный праймеры отжигаются на концевых константных ПЦР-последовательностях (~ 60 п.н.) каждого гибридизационного зонда. Данная ПЦР характеризуется высокой воспроизводимостью, поскольку в реакции принимает участие только одна пара праймеров для амплификации всех зондов разной длины.

mlpa2

Рис. 1. MLPA-реакция

mlpa3

Рис. 2. Этапы MLPA-реакции

После денатурации образца ДНК, к нему добавляют смесь гибридизационных MLPA-зондов. Каждый MLPA-зонд состоит из двух олигонуклеотидов. Если в образце (мишень) присутствует последовательность комплементарная зонду, то оба олигонуклеотида гибридизуются друг за другом, так чтобы быть сшитыми лигазой в единый зонд. Лигированные олигонуклеотидные зонды разной длины затем одновременно амплифицируются в ходе ПЦР с использованием одних и тех же праймеров. Происходит амплификация не ДНК образца (мишени), а мультиплексной смеси лигированных зондов разной длины.

mlpa4

Рис. 3. Этапы MLPA-реакции

Каждый зонд в MLPA-миксе имеет уникальный длину в интервале от 130 до 500 п.о. В ходе ПЦР смесь легированных зондов разной длины амплифицируется одновременно с использованием одной и той же пары праймеров. Один из ПЦР праймеров несет флуоресцентную метку, что позволяет визуализировать продукты амплификации в процессе разделения фрагментов в ходе капиллярного электрофореза (рис. 4, слева).

mlpa5

Рис. 4. А) Электрофореграмма тестируемого образца (внизу) в сравнении с референсным образцом (вверху) показывает относительное снижение высоты пиков трех зондов (показаны стрелками). В) Отношение высот пиков одноразмерных зондов в тестовом и референсном образцах. Размещение зондов в соответствии с их локализацией на хромосоме показывает уменьшение числа копий трех смежных зондов в тестовом образце

Сравнение высоты пиков зондов тестового образца с высотой пиков зондов референсного образца отражает относильное число копий соответствующих целевых последовательностей в тестовом образце. Удаление одной или нескольких целевых последовательностей со всей очевидностью приводит к относительному уменьшению высоты пика (рис. 4, справа), в то время как увеличение относительной высоты пика свидетельствует об амплификации числа целевых последовательностей.

mlpa6

Рис. 5. MLPA-реакция (принцип лигирования)

MLPA – Специальная форма мультиплексной ПЦР

  • Апмплифицируется MLPA-зонд, а не образец ДНК-мишени.
  • Генерируются паттерны пиков от образца ДНК пациента и контрольной ДНК. Сравнивается относительная высота пиков.
  • Различие отражает изменения числа копий последовательностей к которым специфичны зонды.
  • Более 50 гибридизационных зондов присутствует в одной реакции MLPA.
  • Выявляет аномальное число копий более 40 ДНК последовательностей в ходе одной ПЦР реакции
  • Используется:
    • для детекции изменения числа копий
    • определения статуса метилирования импринтинговых и промоторных регионов
    • определения относительного количества мРНК
    • определения известных точечных мутаций (SNP)
  • Требуется минимум ДНК – 20 нг (3000 клеток)
  • Дискриминирует последовательности различающиеся в 1 нуклеотид
  • Работает с деградированной ДНК (парафиновые срезы, фиксированные ткани)
  • MLPA определяет относительное количество целевых последовательностей
  • Женские диплоидные и триплоидные клетки не могут быть различимы

mlpa7

Рис. 6. Определение числа Х-хромосом: 1, 2 и 3 копии на клетку

mlpa8

Рис. 7. ДНК референсного образца (вверху) и ДНК пациента с делецией гена BRCA1 в 13 экзоне (внизу). Анализ выполнен с использованием SALSA® MLPA® probemix P002 BRCA1. Обозначения: с – референсные зонды (зеленые); 1А–24 обозначение зондов для определения соответствующих экзонов гена BRCA1. При сравнении паттерна пиков в образце пациента отчетливо видно снижение высоты пика от зонда соответствующего 13 экзону относительно референсного образца.

Место MLPA среди других методов генетической диагностики

mlpa9

Технология MLPA позволяет выявлять широкий диапазон генетических нарушений – от точечных мутаций единичных нуклеотидов до делеций/дубликаций обширных хромосомных регионов.

Возможные варианты для заказа

mlpa10

Пример заключения «MLPA-эпилепсия»

  • Rosminzdrav
  • Minzdravkk
  • Kuban Online
  • Kuban Edu
  • Mzkk Hotline
  • Patient Info
  • Zr 372 151
  • Know Your Doc 240x100
  • Banner Np Zdrav
  • Banner Nok 3
  • Banner Podsveti Sinim Autism Budem Dobri 1702 852
  • Круг добра
  • Z
  • 2tak Zdorovo 1340x1080